優質檢驗項目:胱抑素C的臨床應用匯總!

發布于:2019-02-18

文章來源:[中文]九強生物

胱氨酸蛋白酶抑制劑的超家

在1981年明確了人類胱抑素C(Cystatin C)的氨基酸系列,但它沒有顯示與當時已知的任何超家族蛋白系列的同源性,事實證明它屬于一個新的蛋白超家族。

圖1. ?人類胱抑素C的氨基酸系列和結構示意圖

陰影區域是木瓜蛋白酶——類似半胱氨酸蛋白酶的抑制位點,它與由Asn殘基組成的legumain抑制位點不重疊;箭頭所示Leu殘基,在腦出血時,它被Gln殘基代替產生胱抑素C的變異體;星號所示Pro3殘基,被部分羥基化。

圖2. (A) 根據胱抑素C二聚體推出的胱抑素C的單體?(B)在胱抑素C的結晶體中發現人類胱抑素C分子是八聚體

胱抑素C的氨基酸序列是胱抑素家族中第一個被檢測的系列,但直到兩年后,只有當研究者檢測了雞胱抑素的結構,并發現此兩種蛋白44%的氨基系列相同,才確定胱抑素C的功能――半胱氨酸蛋白酶的抑制劑。又經二十年的研究,發現了另外十種人類半胱氨酸蛋白酶的抑制劑,并且發現它們與胱抑素C和雞胱氨酸蛋白酶抑制劑有很強的同源性。因此,它們都屬于人胱抑素超家族。

人胱抑素家族目前由11種已明確的蛋白組成。胱抑素家族1由胱蛋白酶抑制劑A和B組成,是**的細胞內蛋白;胱抑素家族2由胱抑素C,D,E,F,S,SA和SN組成,它們主要是細胞外和/或細胞間轉運蛋白;胱抑素家族3由高和低分子量的激肽原(Kininogen)組成,它們主要是血管內蛋白,除了是半胱氨酸蛋白酶的抑制劑外,它們也參與凝結過程和血管活性肽的產生。

表1. 人胱抑素超家族

胱抑素C的生物學功能

胱抑素C除了是木瓜蛋白酶——類似半胱氨酸蛋白酶的抑制劑外,最近被證實,它還能抑制半胱氨酸蛋白酶的其它家族成員,比如人legumain肽酶家族C13一種經典酶。

同時也發現這兩個抑制點是不重疊的(圖1),所以一個胱抑素C分子能同時抑制半胱氨酸蛋白酶的不同類型。最近還發現胱抑素C在動脈粥樣硬化中,抗原呈遞中都起一定作用,并且是中性干細胞的生長因子。除去胱抑素C基因的小鼠(“胱抑素C剔除小鼠”)好像更易癌癥的轉移。

胱蛋白酶抑制劑在體液中的分布

不同的胱抑素在體液中的分布是顯著不同的。比如:胱抑素D主要存在于唾液和淚液中,而胱抑素C存在于各種體液中。在一些體腔中,比如脊髓液中,半胱抑素總摩爾濃度的90%以上是胱抑素C。而在其它的體腔中,比如血漿中,它的比例就很少。而且,在不同的體腔中,總的半胱抑素的濃度也是不一樣的。比如,在血液中總的木瓜蛋白酶抑制劑量大約是12μmol/L,而在腦脊液中它的濃度還不到1μmol/L。和個別的胱抑素范圍一樣,雖然半胱抑素的范圍部分重疊,但是由于每種體液代表了**的一組胱抑素,很明顯,不同的體液也代表了一定的半胱抑素范圍。

圖3?胱蛋白酶抑制劑和α2-巨球蛋白在人類10種體液中的摩爾濃度

血清/血漿胱抑素C作為腎小球濾過率(GFR)的標記物

胱抑素C的產生

人胱抑素C基因結構和啟動子區已證明它是看家基因(house-keeping gene),提示由大多數有核細胞產生的胱抑素C的速率相當恒定。在胱抑素C前體中,疏水性引導序列的出現,更能說明此蛋白通常情況下是被分泌的。事實上,對人組織和細胞系的免疫化學和Nortern印跡的研究中,發現胱抑素C和/或mRNA存在于所有研究過的細胞類型中。無獨有偶,對培養基中人類干細胞系產生胱抑素C的研究中,發現幾乎所有研究的細胞系都能分泌胱抑素C。對大量患者胱抑素C水平的測定中,發現它的水平只影響GFR,而與其它病理情況無關,此結論與胱抑素C是一種被恒定分泌的蛋白相吻合。一些報道表述,在體外刺激巨噬細胞能有規則地減少胱抑素C的分泌,但在發炎情況下通常不會降低胱抑素C的水平。最近一份報道表明,血管平滑肌細胞產生的胱抑素C,可能減少主動脈瘤的發生。

胱抑素C的代謝

一般情況下,分子量低于15-25kDa的血漿蛋白幾乎都能自由通過腎小球濾過膜,然后完全被近端小管細胞重吸收和降解,所以對于分子量只有13kDa,半徑約為30和35?略帶橢圓形結構的胱抑素C來說,理論上也是這樣。實驗上,從做過胱抑素C處理的大鼠的研究中發現,胱抑素C的清除率是經典方法Cr-EDTA清除率的94%,也就表明胱抑素C幾乎全部能自由濾過腎小球。濾過的胱抑素C99%以上發現被管細胞降解。通過限制一組大鼠腎動脈上的主動脈不同程度地降低GFR,發現胱抑素C與Cr-EDTA的相關性非常好 (r=0.99),并且y軸上的截距幾乎在原點,這一研究表明近曲小管吸收的胱抑素C可忽略。對人腎臟的免疫組化和Northern印跡的研究中也發現,胱抑素C在經過腎小球濾膜后,正常情況下,由近曲小管細胞降解。

血清/血漿胱抑素C作為GFR標記物的臨床應用

大多數人組織都能產生胱抑素C,而且作為低分子蛋白,它能自由通過腎小球濾過膜,這就決定了它在血清或血漿中的水平可能是GFR潛在的標記物。在1984-1985早期的研究中已發現,胱抑素C作為GFR的標記物至少與血清肌肝同樣出色。同時研究還發現血清胱抑素C的水平比其它低分子蛋白水平(β2-微球蛋白,視黃醇結合蛋白等)更能反映GFR的情況。但在早期的研究中,胱抑素C濃度的測定只能通過放射免疫擴散方法,此方法非常耗時,需要至少10-20小時,并且CV也相當高(大約10%),這就降低了血清胱抑素C作為GFR標記物的臨床實用價值。10年后發展了完全自動化的乳膠增強比濁法和夾心酶免法,不僅快速而且精密性好,顯著提升了血清胱抑素C在臨床常規工作中作為GFR標記物的可能性。自從1994年,引入了完全自動化的乳膠增強比濁法測定血清胱抑素C后,大多數關于血清胱抑素C作為GFR標記物的文獻中,對于胱抑素C的測定普遍采用商業化的乳膠增強比濁法和1998年引入的商業化的乳膠增強透射免疫比濁法。

盡管相當比例的患者,GFR已經下降,有時甚至降至50%,可血清肌酐仍在正常范圍,但它仍普遍用作GFR的指示劑。血清肌酐作為GFR的標記物受運動,腎小管的分泌和肌酐的重吸收,以及飲食等各種因素的影響。由于這些顯著的缺陷,研究者已開始尋找GFR更好的指示劑。一些**的研究,已開始進行血清胱抑素C和肌酐作為GFR的標記物與注射Cr-EDTA, Tc-DTPA和碘海醇(iohexol)等低分子物質來測定血漿清除率的“金標準”比較。一部分研究顯示,胱抑素C比血清肌酐更能反映GFR的情況,尤其在GFR輕度到中度降低的病人中,另一部分研究顯示兩項參數指標作為GFR的標記物,意義相當。

圖4 在27例男性患者和24例女性患者中,血清胱抑素C的倒數(mg/L)或血清肌酐的倒數(μmol/L)與GFR之間的相關性。―――表示GFR**參考線。在GFR為60-80mL/min×1.73m2時,肌酐為盲區,而血清胱抑素C卻能反映當時的腎情況。

圖5 在51例各種腎功能情況的患者中,用血清胱蛋白抑制劑C和肌酐診斷GFR正常與否(臨界值:80mL/min×1.73m2),準確性方面的ROC圖

幾乎所有的研究者都強調血清胱抑素C與血清肌酐相比,不受性別和肌肉組織的影響。一些研究顯示,隨年齡的增長,GFR顯著下降,在1-50歲的男性和女性個體,血清胱抑素C可使用同一參考范圍。

?在預測禁食者血清同型半胱氨酸總水平時,血清胱抑素C比血清肌酐更好,可能是因它與GFR關系密切有關。

胱抑素C和化學療法

對癌癥病人化療前和化療期間的研究中,發現血清胱抑素C比血清肌酐更能反映肌酐清除率下降的情況,尤其在腎衰竭的早期。研究者建議用血清胱抑素C代替肌酐清除率作為化療前的篩選試驗,也可用于GFR下降病人中劑量的調整。

胱抑素C和糖尿病

已報道血漿/血清胱抑素C是監視非胰島素依賴性的糖尿病初期腎病變的有效工具,效果比血清肌酐和β2-微球蛋白更明顯。

另一份報告顯示,在評估糖尿病患者腎功能是否正常方面,單測胱抑素C濃度比測定血漿肌酐或肌酐清除率更可靠。

新生兒中的胱抑素C

Cataldi等研究了在健康孕婦和她們健康的新生嬰兒的血清胱抑素C水平,結果顯示產婦和嬰兒間胱抑素C的水平無顯著的相關性,相對于肌酐來講嬰兒中的胱抑素C的水平不受產婦血清水平的影響。所以,胱抑素C可以用來監視圍產期婦女GFR的情況。

Finney等研究了早產嬰兒、不滿1月的嬰兒和稍大兒童的血清胱抑素C情況,結果顯示血清胱抑素C比血清肌酐更能反映小孩的GFR情況,因為它與腎功能的成熟情況密切相關。早產嬰兒血漿胱抑素C的水平在所有胎齡期間,都顯著升高,到1歲時達到成人水平。1歲以下兒童血漿胱抑素C水平反映的是腎臟的未成熟度,不需要再進行血清肌酐的測定,因為它受成長過程中肌肉組織增加的影響。

胱抑素C和子癇前期

妊娠性疾病會增加母體和胎兒的危險度;如妊娠性高血壓、腎臟結構的變化和GFR降低以及其他不明原因引起的妊娠性疾病。每年有超過50,000人因妊娠性疾病而死亡。因此需要發展敏感、特異的診斷試驗,以便密切檢測腎功能,確保發展成毒血癥和嚴重腎損傷之前實時分娩。最近的研究表明,血清胱抑素C與血清尿酸和肌酐相比,對子癇前期有較好的診斷準確性。并且已證明Cys C是妊娠并發子癇前期的一個有價值的檢測指標。

圖6 血清胱抑素C和肌酐在診斷妊娠子癇和正?;吃惺?,準確性方面的ROC圖

胱抑素C和腎移植

?Bricon?等人研究了腎移植后的第四天,血漿胱抑素C的水平比肌酐下降急劇。在監視GFR下降方面,也是血漿胱抑素C比血漿肌酐效果更好。在所有四起急性注射發作和一起急性腎毒性發作的研究中,發現血清胱抑素C的濃度與血漿肌酐的濃度在很大范圍內保持一致。有趣的是,血漿胱抑素C比肌酐上升更明顯。如用血清胱抑素C作為指示劑的話,一起急性注射發作和急性腎毒性發作能更早地診斷出。在這些病人3個月的隨訪中,研究者對于Cr-EDTA清除率、血漿胱抑素C、內生肌酐清除率和血漿肌酐各自作為GFR的標記物進行比較。結果顯示肌酐作為GFR的標記物造成30-40%的高估率,并且大約有25%的假陰性,診斷準確性不良。血清胱抑素C能很好地反映GFR情況,并且與Cr-EDTA清除率有很好的相關性,同時不太會引起假陰性。

腎移植術后20% ~ 40%的患者會發生急性排斥反應,如果及早診斷,盡早治療,絕大部分排斥反應可被逆轉并恢復正常腎功能。Cys C在腎移植術后診斷急性排斥反應時明顯優于Scr,即Cys C比Scr提前(2.7±1.8)d升高;與排斥前比較,Cys C升高148.9%,遠高于Scr的43.9%。研究結果表明,腎移植術后Scr緩慢下降,1周左右轉為陰性(低于判斷值122umol/L)而Cys C術后3d內迅速下降,尤以第**為多,可達69.2%,第二天91%的患者即轉為陰性(低于判斷值1.79),也有文獻報道腎移植術后Cys C可立即下降(29.3±1.7)%。Cys C的這一優勢在診斷加速性排斥反應(多見于術后2~5d)時得以發揮優勢效果,而Scr雖有升高,但處于術后下降的背景中,不易觀察;而Cys C可立即由陰性轉為陽性,變化明顯。

感染是腎移植術后最常見的并發癥,術后一年內,約70%的患者至少發生1次感染,而細菌感染占50%以上。研究結果表明,Cys C在腎移植術后診斷感染時雖然升高幅度與Scr無明顯差異,但比Scr早(4.4±1.5)d出現變化,有利于早期發現,這對腎移植患者來說有重大臨床意義。因為腎移植患者感染時,早期癥狀體征不典型或由于免疫抑制劑的作用白細胞和中性粒細胞比例不升高,實驗室檢查不易發現;并且一旦感染,來勢兇,若不及時治療,??傻賈亂浦采齬δ萇ナЩ蛭<吧?。

Cys C可快速提示急性排斥和藥物治療的反應

就檢測腎小球濾過率而言,胱抑素C比肌酐更敏感,器官移植的患者檢測該項目可以幫助快速診斷出急性排斥反應或藥物治療可能造成的腎損害。

1.術后6天,Cys C穩定于基礎水平,表明腎移植后較為平穩

2.腎移植后第**,Cys C與肌酐相比下降更快,更清楚的提示腎功能的情況

3.在不發生并發癥時,術后Cys C的變化范圍低于20%

胱抑素C是診斷早期急性腎損傷的敏感標記物

急性腎損傷(AKI)占到所有住院患者的5%,達到ICU患者的50%,在過去的15年中,AKI病死率并無好轉,早期的AKI經常是可逆的,但診斷經常是滯后的。作為檢出AKI的常規標記物,血肌酐有較多的缺陷。與血肌酐相比,血Cys?C要比肌酐早1.5天檢出AKI。

血清胱抑素C和血清肌酐

血清胱抑素C和血清肌酐雖有差別,但都能正確地鑒別出某一類型的腎小球濾過率紊亂情況。

一些腎臟疾病可能不同程度地影響了胱抑素C(帶正電荷,分子量為13343Da)的濾過情況和肌酐(不帶電荷,分子量為113kDa)的濾過情況。事實上,**的研究也顯示,以胱抑素C代表的GFR,在I型糖尿病患者和蛋白尿病人中,由于腎小球濾過孔徑的縮小而降低,但此時碘拉鹽(iothalamate)清除率(一個613kDa的低分子標記物)卻顯示這些病人GFR正常。因此可用胱抑素C證實分子量范圍大約在10-35kDa的小分子物質的GFR降低。

? ? ? ??另一例子是血清胱抑素C和血清肌酐在腎移植后第一次血液循環和尿液排泄之前的生理差異。因胱抑素C在這期間可能在腎小管細胞濾過和降解,所以血清胱抑素C的水平可能降低。相反,血清肌酐在這期間不會降低,雖然肌酐也是被過濾,但它不會被降解或分泌。事實上,一些移植后階段的研究也證明了此。

低分子量物質和胱抑素C范圍內的分子在腎小球濾過時生理性分解的其他例子是在孕婦中。在孕婦中低分子量物質的GFR升高,胱抑素C范圍內的分子可能降低。

理想的腎小球濾過率(GFR)標志物應具有的性質

腎小球濾過率是反映腎功能的一項重要指標,—般通過測定某些"腎功能標志物"反映GFR,理想的可作為GFR的標志物應具有以下性質:

1.不與血漿蛋白結合,能從腎小球自由濾過

2.不被腎小管重吸收或分泌

3.腎臟是其**的排出器官

4.如是內源性標志物其從組織釋放入血流中的速率應是恒定的,外源性物質則為不在體內代謝轉化的無毒物質。

作為反映腎小球濾過功能的內源性標志物,Cys C是-個比較接近理想的內源性標志物

Cys C是一種低分子量蛋白質,在體液的生理PH值中攜帶正電荷,可經腎小球自由濾過;不被腎小管上皮細胞分泌,雖然在近曲小管被重吸收但被完全分解代謝,不會再重返血流中;腎臟是清除循環中Cys C的**器官;由于Cys?C基因屬"看家基因",能在幾乎所有的有核細胞表達,無組織學特異性,故機體Cys C的產生速率相當恒定。

胱抑素C的穩定性

許多研究都表明胱抑素C在室溫下至少穩定7天,在4℃可穩定幾周,在-20℃或-80℃可穩定幾月。胱蛋白酶抑制劑的水平即使凍融7次以上,濃度也不會改變,并且保存在未分離的血24小時,也不會影響胱抑素C的水平。

血清胱抑素C的參考值

建立臨床能使用的參考值需提供定標液,這樣也有助于鑒定相關定量檢測分析程序是否合格。重組的人胱抑素C很易制備和分離,能用于建立可靠的定標液。

針對國際定標液第一步驟慣例,是生產高純度的重組胱抑素C溶液,通過定量氨基酸測定和分光光度分析測定其濃度,然后用人血清中游離的胱抑素C,稀釋成生理狀態下的濃度?;陔滓炙谻定標液和商品化的微粒子增強透射免疫比濁方法的使用情況,血清胱抑素C參考值的研究人群主要由成人和兒童。成人的結果通常顯示無性別差異,并且隨年齡胱抑素C的水平增加,這與GFR隨年齡降低吻合??墑?,在50歲以下,GFR隨年齡降低的情況不太明顯,故基于實際情況,有人提議應建立分段的參考值(20-50歲和50歲以上)。

圖7 在121位健康女性和121位健康男性(年齡:20-89)中,血清胱抑素C情況。結果顯示無性別差異

兒童胱抑素C的水平與肌酐水平相比有些不同,1歲以上的兒童,胱抑素C的水平已變化不大,且無性別差異,故建議1歲以上小孩的參考值與20-50年齡段的參考值相同為:<1.02mg/L。

圖8 在258位健康兒童(年齡:1天-18歲)中,血清胱抑素C(A)和肌酐(B)的情況。方框區域顯示1歲以上兒童的血清胱抑素C參考范圍。

既然所有低于15-25kDa分子量的血漿蛋白,幾乎都能自由通過正常的腎小球膜,所以它們在人體中的濃度不僅受到產生率的影響,并且在一定程度上還受到GFR的影響。因而,低分子量蛋白的產生速率對疾病的進程有一定的意義,測定那些小分子蛋白水平與胱抑素C的比值,在特異性方面可能比直接測定它們水平要好。比如,年齡影響GFR和β2-微球蛋白的參考值,β2-微球蛋白與胱抑素C的比值不受影響。和單獨測定血漿β微球蛋白相比,該比值可能是細胞增殖的更加特異性的標記物。

推薦使用血清胱抑素C作為GFR的標記物

許多研究表明,與肌酐相比,胱抑素C是GFR較好的標記物;尤其在鑒別早期GFR的小幅降低時,這一區域被稱為肌酐GFR盲區。為了胱抑素C在臨床上的有效使用,需要精密度好的定量方法,使用無濁度的標本。至少目前采用的微粒子增強透射免疫比濁法能符合精密度要求,但是只有不斷完善的方法保證不受濁度的影響時,無濁度的空腹標本才能使用。血清肌酐和胱抑素C的聯合測定,能提供更多準確的GFR的信息,?但是由于生物醫學或經濟的原因不能進行侵襲性和昂貴的清除檢測方案。假如胱抑素C和肌酐均在相應的參考范圍內,漏診GFR下降的機會非常少。

當GFR被有侵襲性的清除方法測定后,血清胱抑素C可作為肌酐的替代試驗隨訪GFR的變化。

血清胱抑素C作為GFR的標記物在應用中應注意的問題

當完全自動化的微粒子增強透射免疫比濁方法第一次被介紹時,聲稱該方法不受高甘油三酯的影響??墑?,隨著方法的普及,發現結果受標本內在的乳糜微粒血癥引起濁度的影響,而乳糜微粒血癥可能影響胱抑素C的濃度。乳糜微粒血癥對于分析方法的影響可解釋為已報道過的胱抑素C有相當大的生物變異,這就使研究人員提供不出胱抑素C作為GFR的標記物比肌酐的更多優勢。從胱抑素C的生物變異的研究中發現,用無濁度的標本,胱抑素C完全能替代肌酐作為GFR的標記物。

研究也發現,一些類風濕因子也能干擾微粒子增強透射免疫比濁方法,會使結果假性偏高。

但值得強調的是,雖然完全自動化的微粒子增強透射免疫比濁法比第一次用于定量測定胱抑素C的免疫擴散精密度高,但是比測定肌酐的絕大多數的方法來說,它們的精密度還是低的。并且,胱抑素C的個體間差異,也強烈要求需要高精密度的方法,只有這樣才能通過Cotlove標準,顯著提高血清胱抑素C的臨床使用價值。

胱抑素C校準品溯源性簡介

血清胱抑素C已被認為是反映腎小球濾過率的一個理想指標。然而由于校準品與測定方法的差異,往往導致結果差異較大。因此IFCC工作組于2007年提出了胱抑素C標準化方面的問題,并指定由DAKO、Roche、Dade Behring公司與歐盟參考材料和檢測研究院(IRMM)等實驗室負責標準化方面的工作,并于2010年5月推出了可溯源至ERM?-DA471/IFCC的胱抑素C參考材料。

基于胱抑素C濃度的GFR方程

胱抑素C濃度與慢性腎病的關系

轉自:MIR醫學儀器與試劑

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